Italiano: Il flusso di lavoro per un tipico esperimento di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) può essere suddiviso in diverse fasi, tra cui la preparazione del campione, la preparazione della griglia, la raccolta dei dati, l'elaborazione delle immagini e la determinazione della struttura. Ecco una breve panoramica di ogni fase:

1. Preparazione del campione: Questo implica la purificazione del campione biologico di interesse, come una proteina, un complesso proteico, un virus o una cellula. Il campione deve trovarsi in uno stato purificato e omogeneo, privo di contaminanti e aggregati. A seconda del campione, possono essere utilizzate diverse tecniche come la cromatografia per esclusione di dimensioni, la cromatografia di affinità o l'ultracentrifugazione per la purificazione.

2. Preparazione della griglia: Il campione purificato viene poi applicato a una griglia speciale per la microscopia elettronica, generalmente realizzata in carbonio o oro. La griglia viene trattata prima con uno strato sottile di polimero idrofilico per evitare che il campione aderisca alla griglia. Successivamente, il campione viene applicato alla griglia e l'eventuale eccesso di soluzione viene asciugato. La griglia viene quindi rapidamente congelata in etano o propano liquido per creare uno strato sottile di ghiaccio vitrificato attorno al campione.

3. Raccolta dei dati: Le griglie congelate vengono caricate in un microscopio elettronico a criomicroscopia, e le immagini vengono acquisite utilizzando un fascio di elettroni. Il microscopio può essere operato sia in modalità automatizzata che manuale. In modalità automatizzata, il software del microscopio seleziona automaticamente le griglie e acquisisce immagini da diverse aree sulla griglia. In modalità manuale, l'utente seleziona manualmente le regioni di interesse sulla griglia da immagazzinare. Tipicamente, vengono raccolte centinaia o migliaia di immagini da diverse angolazioni, che verranno utilizzate per ulteriori elaborazioni.

4. Elaborazione delle immagini: Le immagini raccolte vengono elaborate per migliorarne la qualità e generare una ricostruzione tridimensionale del campione. Questo coinvolge diverse fasi, tra cui la selezione delle particelle, la classificazione bidimensionale, la media e il raffinamento. Nella selezione delle particelle, le singole particelle nelle immagini vengono identificate ed estratte. Nella classificazione bidimensionale, le particelle vengono suddivise in diverse classi in base alle loro orientazioni e somiglianze.

5. Ricostruzione tridimensionale: Le particelle ordinate vengono utilizzate per generare una mappa di densità tridimensionale del campione.

6. Costruzione e raffinamento del modello: Una volta ottenuta la mappa tridimensionale, è possibile costruire un modello strutturale della proteina o del complesso utilizzando metodi computazionali. Il modello viene raffinato iterativamente confrontandolo con la mappa cryo-EM e apportando aggiustamenti fino a ottenere un modello di alta qualità.

Il modello strutturale può essere analizzato per ottenere informazioni sulla struttura e sulla funzione della proteina o del complesso, come ad esempio capire come interagisce con altre molecole o come catalizza reazioni chimiche.